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低温生物菌种——菌种分离方法介绍

孢子分离又可分为以下几种方法：

( 1 ）褶上涂抹法：选取新鲜、健壮、未开伞、未裂破的子实体，洗净后用75 %酒精表面灭菌2 分钟，然后连同培养基一起放入接种箱内，经熏蒸消毒12 ～ 24 小时，再按无菌操作技术将接种环在子实体菌褶上涂抹，把涂抹后带孢子的接种环在培养基上划线接种，，后置于25 ～ 28 ℃恒温箱内培养，可得纯菌种。

( 2 ）孢子印采集法：取灭过菌的载玻片、试纸或黑布，置于新鲜、未开伞或未开裂的子体菌褶的下方。经24 小时后，便落下孢子，形成印痕（即孢子印）。然后，用接种环或玻璃棒蘸取孢子，接种在平面或斜面培养基上，进行恒温培养，可得纯菌种。

( 3 ）孢子收集器采集法：孢子收集器由玻璃钟罩、培养皿、三角架、搪瓷盘等组成。钟罩下为一搪瓷盘，直径25 厘米左右，盘内先垫衬4～6 层纱布，中央放1 副9 厘米直径的培养皿，大盖口朝下，上放小的，口向上。然后，在上面小的培养皿上放1 只铅丝绕成的三角架，再将带孔的玻璃钟罩盖上，顶上罩孔用棉塞塞好，用纱布包好整个孢子收集器，置于高压灭菌锅或蒸笼内灭菌2小时。

孢子收集器灭菌消毒后，放入无菌室或无菌箱内。然后，用小刀割取1 块4～5 厘米大小的子实体，插在收集器内的三角架顶上（若无孢子收集器，也可用培养皿代替）。再置于温度24 ～26 ℃下培养24 小时，培养皿中便可见到白色粉状物，此即为孢子。此时，可将孢子收集器再移至接种箱内，取出培养皿，盖好，并在培养皿内加入10 ～ 20 毫升的无菌水，使孢子散于本中，成为孢子悬浮液。然后，再用无菌打针筒或吸管吸取孢子悬浮液，接种于试管斜面培养基上，每管注2 ～ 3 滴。置于24 ～ 26 ℃温度下培养5 ～ 7 天，培养基上便可长出白色菌落。待菌落直径有0 . 5 厘米时，选健壮的菌落，再移接于另一试管的斜面培养基上培养。当白色菌丝长满试管时，便得纯菌种。

生物有机肥产品生产安全性分析

虽然目前生物有机肥产品生产大多采用植物根际促生菌， 但近年来很多研究发现，芽孢菌属和类芽孢菌个别菌株能产生菌素。 即便在安全分级目录中列为一级免做理学试验的， 开展生物有机肥产品生产生物安全风险评价， 从源头上把好安全关是产品质量安全的首要保障。通过调研发现， 用于生物有机肥产品的部分生产分类地位不明确， 甚至混乱， 难以从源头上进行安全风险的初步识别 。 以常见生产枯草芽孢菌为例， 实际上是一个表型相似的群体， 包括枯草芽孢菌、 地衣芽孢菌、 短小芽孢菌、解淀粉芽孢菌、 深褐 （萎缩） 芽孢菌、莫哈韦（莫杰夫） 芽孢菌、 死谷芽孢菌、 索诺拉沙漠芽孢菌、 特基拉芽孢菌、暹罗芽孢菌等 10个缘种。生产企业送检的枯草芽孢菌生物有机肥产品， 经鉴定发现很多产品实际为解淀粉芽孢菌， 且许多菌株具有很强的溶血作用。通过对生产企业调研发现， 部分生产企业选择分离于动物肠道的解淀粉芽孢菌作为产品生产用菌株， 该类生产发酵周期短、 活菌数量高、 生产成本低， 但产品的应用功效不佳， 溶血风险大 ， 建议慎用。而植物来源的解淀粉芽孢菌溶血风险小， 产品应用效果好， 推荐使用。

什么是低温生物菌种？

低温生物菌种又称生物肥料、接种剂或菌肥(bacterial manure)等，是指以微生物的生命活动为核心，使农作物获得特定的肥料效应的一类肥料制品。微生物肥料和微肥有本质的区别：前者是活的生命，而后者是矿质元素。微生物资源丰富，种类和功能繁多，可以开发成不同功能、不同用途的肥料。而且微生物菌株可以经过人工选育并不断纯化、复壮以提高其活力，特别是随着生物技术的进一步发展，通过基因工程方法获得所需的菌株已成为可能。巨大芽孢菌、胶质芽孢菌、固氮芽孢菌、球形芽孢菌、侧孢短芽孢菌等被广泛用于生产生物肥料。

生物菌种存活必备条件

1、保持土壤合理湿度

高温闷棚前，菜农多进行土壤翻耕，使得浇水水量极大，土壤湿度过高，通透性差，影响生物菌的增殖。因此，闷棚浇水时，要先起垄，浇小水保证土壤较为湿润即可，不要大水漫灌。

2、闭棚后不要立即升温

底肥需要生物菌发酵，若翻入土壤后立即浇水升温，多数菌种被扼杀，仅有少量嗜热菌可以存活，但粪肥发酵仅靠嗜热菌是完成不了的。

建议菜农翻地浇水后间隔几天，待土壤湿度降低，生物菌大量繁殖后再覆盖地膜、关闭通风口进行闷棚，此时低温菌种已经发挥作用，可以产生大量热量辅助闷棚，可大大改善闷棚效果。

3、促进生物菌快速繁殖

想要促进微生物快速增殖，可使用菌种含量高的菌剂，例如20亿的，可充分发挥菌剂作用。菜农要学会换位思考，生物菌喜欢什么样的条件，就创造什么样的条件，如此才能确保闷棚效果。